小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞操作說(shuō)明

種屬：小鼠

組織來(lái)源：正常骨髓血組織

傳代比例：1:2傳代

培養(yǎng)基配置：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml；生長(zhǎng)添加劑5ml；胎牛血清50ml；雙抗5ml

簡(jiǎn)介 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)骨髓中的造血干細(xì)胞（HSC）不僅有機(jī)械支持作用，還能分泌多種生長(zhǎng)因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）來(lái)支持造血。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，能促進(jìn)間充質(zhì)組織的再生，如：骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)等組織。在骨髓中，BMSCs占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%~0.1%，含量極低。而同時(shí)，由于組織工程需要大量的種子細(xì)胞，從嚙齒類動(dòng)物骨髓分離BMSCs的技術(shù)上的難度限制了許多實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。體外分離培養(yǎng)純度高、活力強(qiáng)、生物特性均一的BMSCs對(duì)組織工程及細(xì)胞的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)顯得至關(guān)重要。

形態(tài)：長(zhǎng)梭形細(xì)胞樣，不規(guī)則細(xì)胞樣

生長(zhǎng)特征：貼壁生長(zhǎng)

細(xì)胞檢測(cè)：CD44免疫熒光染色為陽(yáng)性免疫熒光鑒定，細(xì)胞純度可達(dá)90%以上，不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

倍增時(shí)間：每周 2 至 3 次

換液頻率： 2-3天換液一次

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

凍存條件：凍存液：90%FBS，DMSO 10%, 或使用非程序凍存液：貨號(hào)H-W-50/100

產(chǎn)品使用：于科學(xué)研究，不可作為動(dòng)物或人類疾病的治療產(chǎn)品使用。

細(xì)胞接收處理流程：

1：觀察有無(wú)破損漏液情況，如有請(qǐng)拍照及時(shí)聯(lián)系客服。

2：酒精消毒培養(yǎng)瓶表面后顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，觀察拍照后不用打開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋 放入培養(yǎng)箱靜止2-3小時(shí)穩(wěn)定 細(xì)胞狀態(tài)。

3：請(qǐng)按照細(xì)胞操作指南進(jìn)行次傳代凍存處理。

4：產(chǎn)品隨貨會(huì)附帶細(xì)胞說(shuō)明書、細(xì)胞培養(yǎng)操作指南、細(xì)胞鑒定、支原體檢測(cè)報(bào)告。

5：若產(chǎn)品有異?；蚱渌蓡?wèn)，可隨時(shí)聯(lián)系客服；轉(zhuǎn)至技術(shù)支持。

常溫細(xì)胞收貨當(dāng)天處理方式

1.收到常溫細(xì)胞后，及時(shí)拍照記錄有無(wú)漏液/瓶身破損現(xiàn)象。

2. 鏡下觀察有無(wú)微生物污染現(xiàn)象，拍照記錄不同倍數(shù)鏡下細(xì)胞狀態(tài)和有無(wú)染菌現(xiàn)象， 方便后續(xù)售后處理。

3. 消毒后，更換贈(zèng)送的培養(yǎng)液放置培養(yǎng)箱靜止2-3小時(shí)。如細(xì)胞有多數(shù)懸浮細(xì)胞需要離心收集重新接種止培養(yǎng)瓶。

4. 觀察細(xì)胞密度若超過(guò) 80%則可正常傳代處理(有的原代細(xì)胞不可傳代，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況決定)，傳代推薦比例 1：2 到 1：3（按實(shí)際收貨細(xì)胞密度決定，若不確定 可聯(lián)系技術(shù)支持）；若細(xì)胞密度不到 80%則可繼續(xù)培養(yǎng)，注意擰松瓶蓋或更換透氣瓶蓋；懸浮細(xì)胞注意離心所有培養(yǎng)基以收集細(xì)胞。

5. 由于氣溫，運(yùn)輸?shù)扔绊懺斐少N壁細(xì)胞漂浮的，請(qǐng)將細(xì)胞離心收集后在離心管中消化后進(jìn)行傳代（參考附件），或及時(shí)聯(lián)系技術(shù)支持進(jìn)行指導(dǎo)傳代。

貼壁細(xì)胞傳代：1.從培養(yǎng)容器中吸出用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基并丟棄；

2.從與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液以避免攪動(dòng)細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次

3. 從培養(yǎng)容器中吸出沖洗液并丟棄，向培養(yǎng)瓶中加入預(yù)熱的胰酶；胰酶量應(yīng)足以覆蓋細(xì)胞層 (T25為1ml)；

4.將培養(yǎng)容器在室溫下孵育約 2分鐘（請(qǐng)注意實(shí)際孵育時(shí)間根據(jù)所用細(xì)胞系不同而有所差異）；

5.在顯微鏡下觀察細(xì)胞解離情況；如果解離程度未達(dá) 90%，可將孵育時(shí)間延長(zhǎng)幾分鐘，每 30 秒鐘檢查一次解離情況；

6.細(xì)胞解離程度大于等于 90%時(shí)，傾斜培養(yǎng)容器，使細(xì)胞上液體盡快流盡；加入所用解離劑兩倍體積的預(yù)熱生長(zhǎng)培養(yǎng)基；吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使培養(yǎng)基分散；

7.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15mL 無(wú)菌離心管中，以 200×g 的離心力離心 3-5 分鐘 （請(qǐng)注意離心速度和時(shí)間依細(xì)胞種類不同而有所差異）；

8.用最少體積的預(yù)熱生長(zhǎng)培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液按照推薦比例稀釋，并將適量體積的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，把細(xì)胞放回培養(yǎng)箱（注：如果使用培養(yǎng)瓶，將其放入培養(yǎng)箱前應(yīng)將瓶蓋旋松，以便進(jìn)行充分的氣體交換，除非您使用的是通氣式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋）。

懸浮細(xì)胞傳代：將 T25 培養(yǎng)瓶中的懸液收集至離心管中 1000rpm 離心 5min，收集上清，加 1-2ml 培養(yǎng)基重懸，按 1:2 比例進(jìn)行比例傳代分到新T25瓶中，補(bǔ)充5-8ml/瓶新的培養(yǎng)基 ，最后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。