人真皮毛乳頭細(xì)胞永生化

細(xì)胞接收處理流程：

1：觀察有無(wú)破損漏液情況 ，如有請(qǐng)拍照及時(shí)聯(lián)系客服。

2：酒精消毒培養(yǎng)瓶表面后顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài) ，觀察拍照后不用打開培養(yǎng)瓶蓋 放入培養(yǎng)箱靜止2-3小時(shí)穩(wěn)定 細(xì)胞狀態(tài)。

3：請(qǐng)按照細(xì)胞操作指南進(jìn)行次傳代凍存處理。

4：產(chǎn)品隨貨會(huì)附帶細(xì)胞說(shuō)明書、細(xì)胞培養(yǎng)操作指南、細(xì)胞鑒定、支原體檢測(cè)報(bào)告。

5：若產(chǎn)品有異?；蚱渌蓡?wèn) ，可隨時(shí)聯(lián)系客服；轉(zhuǎn)至技術(shù)支持。

細(xì)胞接收后的處理

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-4h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）靜置完成后，請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10× , 20×) 各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）懸浮細(xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基）。

4）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過(guò)程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上，可

以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過(guò)程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收 。

5）半貼細(xì)胞和貼壁不牢（懸浮）細(xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱中約2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況，若細(xì)胞密度在60%以下，客戶需收集T25瓶中的懸浮細(xì)胞離心后用培養(yǎng)基重懸后打回到原培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，若細(xì)胞生長(zhǎng)70%-90%對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳代時(shí)需要收集培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞離心后回收。

6）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。    收到細(xì)胞后次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

細(xì)胞處理：

1. 復(fù)蘇細(xì)胞：從液氮灌中或-80℃冰箱中查找到需要復(fù)蘇的細(xì)胞，水浴鍋提前打開預(yù)熱 37℃。

1) 將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍；

2) 加入到含4-6mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。

3) 棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基接種于 T25 培養(yǎng)瓶中（或 6cm 皿中），

培養(yǎng)過(guò)夜，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2. 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1) 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次；

2) 加 1-2mL 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 2-3min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后，加 5ml 以上含 10%血清的培養(yǎng)基終止消化；

3) 輕輕吹打細(xì)胞，脫落后吸出至離心管中，1000rpm離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻；

4) 按 5-6mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液按 1:2 到 1:3 的比例分到新的含 6-8mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中或者培養(yǎng)瓶中。

（即 1 個(gè) T25 傳代接種至 2~3 個(gè) T25 或者 2~3 個(gè)直徑為 6cm 的培養(yǎng)皿）

3. 細(xì)胞凍存：

1）細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1× 10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.

2）1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每 1ml凍存液含1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、 日期等信息。

3） 按凍存數(shù)量加入無(wú)血清凍存液后直接放-80℃冰箱過(guò)夜，后續(xù)可轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。