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人卵巢細胞系：KGN細胞，COV434細胞，IOSE80細胞，SKOV3細胞，OVCAR3細胞，HEY細胞等

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HTR8-SVneo細胞，人胎盤絨毛滋養(yǎng)層細胞株（細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種，分別是細菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細胞污染，那么他們污染細胞的特點分別是什么呢？怎樣能夠減少污染現(xiàn)象的發(fā)生？）

1-細菌

細菌污染常見的有大腸桿菌，葡萄球菌等。細菌污染較易發(fā)現(xiàn)，在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，培養(yǎng)液一般會在短時間內(nèi)變黃，有時靜置的培養(yǎng)液不混，稍加震蕩會有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在，細胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。

處理：①在培養(yǎng)液中加入相應的抗生素，能夠預防絕大多數(shù)的細菌污染。

2-真菌

真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種，尤其梅雨季節(jié)快要到了，進行細胞培養(yǎng)時更易污染。污染細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。

很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。

真菌污染后，細胞生長變慢，但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。真菌生長的比較慢，不象細菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細胞就被污染了，也很難救活了。

3-支原體

支原體的大小介于細菌和病毒之間，是一種獨立生活的微生物。對熱敏感，對一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變，多吸附在細胞表面和細胞之間。電鏡下觀察，中心有高密度的密集顆粒，橫斷面與細胞微絨毛相似。

因國內(nèi)的血清大多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測，而支原體又是牛血清中zui常見的微生物之一。支原體污染細胞后，培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁．但細胞變化不顯著，隨著細胞的培養(yǎng)會慢慢死亡。

支原體污染檢測（熒光染色法）：DNA和與DNA特異性結合的熒光染料結合，使得支原體的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。

解決：

1）抗生素排除法：支原體污染預防比解決好。如果不小心污染后，可加入高濃度抗生素（常規(guī)使用的5倍濃度）作用24-48小時，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，但該法不保證有效。推薦用量：慶大霉素 200μg/ml ,四環(huán)素10μg/ml ，卡那霉素50μg/ml 。

2）加溫除菌：支原體不耐熱，可以對支原體污染的細胞熱處理除菌。因高溫對細胞本身也會產(chǎn)生一定影響，故熱處理前需先進行預實驗，確定對細胞影響zui小而能zui大程度的殺死支原體的時間。

4-黑膠蟲

黑膠蟲的存在目前尚有爭議，其在低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。

5-原蟲

培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細小的點狀物數(shù)量非常多，輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細胞站優(yōu)勢所以不會影響到細胞的正常生長，只有當他們到達一定的數(shù)量時就會影響到細胞的生長，zui終形成惡性循環(huán)。

6-病毒

組織細胞培養(yǎng)過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。 盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

7-非同種細胞污染

即細胞交叉污染，由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。非細胞培養(yǎng)物所造成的化學成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學物質(zhì)所致。

污染是細胞培養(yǎng)的大敵，預防和避免污染是成功培養(yǎng)細胞的關鍵之一。危機意識要貫徹實驗的始終，否則不僅浪費時間，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的損失。

 （如何預防細胞培養(yǎng)的污染和清除這些污染物呢？）慧穎 細胞庫 技術為您解答：

一、污染的預防

預防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法。只有預防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度。一般預防可從以下幾方面著手：

1-從操作者做起

1操作者責任心要強，要細心穩(wěn)重，操作技術要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。進入后關好門，坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大批污染。

2、操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應轉(zhuǎn)向背面。

3、操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢及時收拾，保持實驗室清潔整齊，zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

2-從物品、用品消毒滅菌著手

細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要*，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

3-防止細胞交叉污染

在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分，做上標記便于辨別。并按順序進行操作，避免一起進行時易發(fā)生混亂。

在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。

所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復蘇，重新培養(yǎng)。

二、污染的清除

培養(yǎng)細胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之；有細胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后*消毒操作室，復蘇或重新購置細胞，再培養(yǎng)。若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

1-使用抗生素

抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素（青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL），污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環(huán)素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理，每隔2～3日換液1次，傳1～2代進行治療。近年來有報道，4-氟，2-羥基喹啉（Ciprofloxacin,Cip）、截耳素衍生物（Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物（BM-2）等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250濃縮液，-20℃保存?zhèn)溆?，使用濃度Cip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL。使用時先吸除污染的培養(yǎng)液，加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液，3天后再吸除培養(yǎng)液，加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天，如此連續(xù)3個輪次，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后，再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次。

2-使用支原體特異性血清

用5%的兔支原體免疫血清（血凝效價1:320以上）可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟。

3-加溫處理

將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。所以在處理前要進行預試驗，摸索能zui大限度殺死支原體又對細胞影響zui小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳。

4-其他方法

除了上述去除污染的方法外，還有動物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價值，一般均棄之重新培養(yǎng)。

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