TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) (TUNEL Apoptosis Assay)是一種高靈敏度又快速簡(jiǎn)便的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。對(duì)于待檢測(cè)的細(xì)胞或組織樣品，經(jīng)過生物素標(biāo)記和后續(xù)的DAB顯色等步驟，即可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞。

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。

基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標(biāo)記的dUTP(Biotin-dUTP)，隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結(jié)合，zui后在HRP的催化下通過DAB顯色來(lái)顯示凋亡細(xì)胞，從而可以通過普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)到凋亡的細(xì)胞。

技術(shù)步驟

1. 材料與試劑 (以Promega試劑盒為例)，包括：

(1)生物素標(biāo)記的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標(biāo)記的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/µL

(2)TdT酶（25U/μL）

(3)反應(yīng)緩沖液

(4)洗滌緩沖液

(5)異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的親合素或鏈霉親合素（2.5µg/mL）或抗地高辛抗體（1︰30）

(6)PI染液（含PI 5µg/mL及無(wú)DNA酶活性的RNA酶0.1%）

(7)PBS緩沖液

(8)塑料蓋玻片

2. 樣品

(1)懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的甩片或涂片

(2)貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞

(3)冰凍切片

(4)常規(guī)石蠟切片

3. 操作方法

(1)固定：培養(yǎng)細(xì)胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常規(guī)4%中性福爾馬林固定、石蠟包埋之切片進(jìn)行脫蠟、水化。

(2)洗滌：玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5min，三次。

(3)反應(yīng)：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細(xì)胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加反應(yīng)液（每50μL反應(yīng)液含TdT酶0.5μL,標(biāo)記的-dUTP 1μL），使反應(yīng)液均勻地覆蓋于所有細(xì)胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37℃孵育1h。

(4)終止反應(yīng)：去掉塑料蓋玻片，將玻片置盛有洗滌緩沖液的染色缸內(nèi)，洗滌兩次，每次5min。

(5)FITC標(biāo)記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細(xì)胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加FITC反應(yīng)液（含F(xiàn)ITC 2.5μg/mL），室溫下避光孵育10min。

(6)洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi)，洗兩次，每次5min。

(7)PI復(fù)染：將玻片置于盛有PI染液的染色缸內(nèi)，室溫下避光染色30min。

(8)封片：用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上，亦可用無(wú)色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，盡早鏡檢觀察。

4. 結(jié)果判定：用熒光顯微鏡觀察，選用藍(lán)色激發(fā)光（波長(zhǎng)488nm），所有的細(xì)胞核均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細(xì)胞被特異地標(biāo)記上FITC，顯示出黃綠色熒光。

應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞凋亡(apoptosis)的分析方法，細(xì)胞凋亡有一項(xiàng)重要的特征為細(xì)胞內(nèi)的DNA會(huì)碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探測(cè)DNA片段的產(chǎn)生。

服務(wù)周期

交貨時(shí)間： 15~20天

客戶須知（對(duì)材料的要求、注意事項(xiàng)）

結(jié)果提供： 正常和陽(yáng)性對(duì)照玻片及其1張數(shù)碼照片，剩余石蠟塊，檢測(cè)報(bào)告；

樣本要求：取材保持組織新鮮（組織塊以小于2cm×1.5cm×0.3cm為宜），立即放入固定液（固定液用10%福爾馬林液或4%多聚甲醛緩沖液，體積為組織塊的10倍以上）中，避免干燥；對(duì)于有血跡的樣本，可用PBS液或生理鹽水沖洗后直接放入固定液中；經(jīng)固定后的樣本必須在48小時(shí)內(nèi)處理。

血清是一種成分復(fù)雜的混合物，不同批次血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用不同。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中由血清引起的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳及病毒滴度的影響表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1、細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢，長(zhǎng)滿單層時(shí)間長(zhǎng)；從同一細(xì)胞瓶中分出兩瓶細(xì)胞，用同一種培養(yǎng)液，分別加入10％的對(duì)照血清和待檢血清，在相同條件下培養(yǎng)72小時(shí)，會(huì)出現(xiàn)對(duì)照血清長(zhǎng)滿單層，而待檢血清大約只有60～70％，這種血清就不適合用來(lái)大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。

2、細(xì)胞傳代后形態(tài)不正常，細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生變化 ；由于血清的質(zhì)量問題，使原本狀態(tài)正常的細(xì)胞經(jīng)傳代后形態(tài)會(huì)變差；比如：細(xì)胞瓶里會(huì)出現(xiàn)一些蠕動(dòng)的小黑點(diǎn)（并非污染），或者細(xì)胞表面形成一層油狀覆蓋物；細(xì)胞的輪廓變得模糊，細(xì)胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充，從而影響細(xì)胞向四周擴(kuò)展生長(zhǎng)。

3、細(xì)胞傳幾代后就出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象，不能連續(xù)傳代 ；質(zhì)量較差的血清缺乏某種細(xì)胞的貼壁因子，會(huì)使細(xì)胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力。細(xì)胞會(huì)從正常的貼壁狀態(tài)，邊緣開始萎縮，上翹。觀察到的現(xiàn)象就是細(xì)胞表面不光滑，晃動(dòng)細(xì)胞瓶會(huì)看到細(xì)胞表面有絮狀物隨培養(yǎng)液波動(dòng)。隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞萎縮的情況越來(lái)越嚴(yán)重，直到zui終*脫壁而死亡。

4、細(xì)胞長(zhǎng)的很好，致密的單層，狀態(tài)也很正常，但是接毒后細(xì)胞基本不發(fā)生病變，做滴度檢測(cè)幾乎測(cè)不出抗原滴度。這種情況也許是因?yàn)檠逯泻信c接種的病毒有同源的特異性抗體。比如血清中經(jīng)常會(huì)存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等，如果存在這些抗體，就會(huì)把接進(jìn)去的病毒給中和掉。如果抗體滴度很高，病毒會(huì)被抗體*中和，就沒有病毒顆粒在細(xì)胞中增殖，所以會(huì)檢測(cè)不到病毒滴度。這種情況給疫苗企業(yè)造成的損失是相當(dāng)大的，不產(chǎn)毒等于前面所做的那么多工作全部白費(fèi)，浪費(fèi)人力、物力，尤其是時(shí)間上的浪費(fèi)，從培養(yǎng)細(xì)胞開始到接病毒，到收液至少需要一兩個(gè)月，一旦出現(xiàn)不產(chǎn)毒的情況，那么這一兩月時(shí)間就白白浪費(fèi)掉了，這也是牛血清給疫苗企業(yè)造成的風(fēng)險(xiǎn)之一。

5、細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)一般，產(chǎn)毒少，毒價(jià)低。這種情況比較常見，細(xì)胞是病毒的載體，由于血清質(zhì)量不好，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，病毒就無(wú)法進(jìn)行正常的復(fù)制。并非所有病毒都不能復(fù)制，所以就造成疫苗的效價(jià)不夠，可能造成不合格產(chǎn)品。

看來(lái)一款血清直接關(guān)系細(xì)胞的生死存亡，不用擔(dān)心，慧穎提供無(wú)支原體，低內(nèi)毒素和低血紅素的，無(wú)反復(fù)凍融的高品質(zhì)血清

慧穎生物專業(yè)血清10年，我們不生產(chǎn)血清，我們只是高品質(zhì)動(dòng)物血清的搬運(yùn)工

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產(chǎn)品名稱    貨號(hào)    來(lái)源    規(guī)格    市場(chǎng)價(jià)格

胎牛血清FBS Sv30087.01  SOUTH AMERICA   100ML   800

胎牛血清FBS Sv30087.02  SOUTH AMERICA   500ML   1800

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

特級(jí)胎牛血清FBS SH30396.03  Canada  500ML   3900

特級(jí)胎牛血清FBS SH30396.03  Canada  500ML   3900

特級(jí)胎牛血清FBS SH30070.03  USA 500ML   3900

特級(jí)胎牛血清FBS SH30070.03  USA 500ML   3900

特級(jí)胎牛血清FBS SH30070.03E USA 500ML   5600

特級(jí)胎牛血清FBS SH30070.03E USA 500ML   5600

標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS SH30370.03  AUSTRALIA   500ML   2800

標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS SH30370.03  AUSTRALIA   500ML   2800

活性炭/葡聚糖處理胎牛血清Charcoal Stripped FBS  SH30068.03  USA 500ML   6000

活性炭/葡聚糖處理胎牛血清，熱滅活，Charcoal Stripped FBS    SH30068.03HI    USA 500ML   6000

新生牛血清New born calf serum   SH30406.01  New Zealand 500ML   1300

馬血清Horse Serum   SH30074.03  USA 500ML   980