慧穎生物淺談細胞破碎技術

1引言：

自年代初重組技術得到廣泛應用以來，生物技術發(fā)生了質(zhì)的飛躍, 生物產(chǎn)品的數(shù)量越來越多，許多具有重大應用價值的產(chǎn)品應運而生，如具有顯著醫(yī)療作用的胰島素、干擾素、生長激素、白細胞介素一等, 它們的基因分別在宿主細胞如（大腸桿菌或酵母細胞）內(nèi)克隆表達成為基因工程產(chǎn)物，從而提高了產(chǎn)量，降低了成本。很多基因工程產(chǎn)物都是胞內(nèi)物質(zhì)如上述藥物經(jīng)克隆表達后都屬胞內(nèi)物質(zhì)，分離提取這類產(chǎn)物時，必須將細胞破壁，使產(chǎn)物得以釋放，才能進一步提取。因此細胞破碎是提取胞內(nèi)產(chǎn)物的關鍵性步驟，破碎技術的研究更加引起基因工程專家和生化工程學者的關注。

2 細胞破碎技術的概述：

細胞破碎技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術，是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎。 結(jié)合重組DNA技術和組織培養(yǎng)技術上的重大進展，以前認為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。目前已發(fā)展了多種細胞破碎方法，以便適應不同用途和不同類型的細胞壁破碎。破碎方法可規(guī)納為機械法和非機械法兩大類。細胞的機械破碎主要有高壓勻漿法、珠磨法、撞擊破碎法和超聲波破碎法等方法，本文主要介紹高壓勻漿法和珠磨法。

3 高壓勻漿法：

高壓勻漿法是大規(guī)模破碎細胞的常用方法，高壓勻漿器是該法所采用的設備，它由高壓泵和勻漿閥組成。它是利用高壓迫使懸浮液通過針形閥，由于突然簡壓和高速沖擊撞擊造成細胞破裂，在高壓勻漿器中，細胞經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞和由高壓到常壓的突變，從而造成細胞壁的破壞，細胞膜隨之破裂，胞內(nèi)產(chǎn)物得到釋放。

3.1破碎機理

同所有的機械破碎方式一樣，高壓勻漿法破碎細胞實質(zhì)上是將細胞壁和膜撕裂，靠胞內(nèi)的滲透壓使其內(nèi)含物全部釋放出來。破碎的難易程度無疑由細胞壁的機械強度決定，而細胞壁的機械強度則由微生物的形態(tài)和生理狀態(tài)決定。因此細胞的培養(yǎng)條件, 包括培養(yǎng)基限制型或復合型、生長期對數(shù)期、靜止期、稀釋率等, 都對細胞破碎有影響胞內(nèi)物質(zhì)的釋放快慢則由內(nèi)含物在胞內(nèi)的位置決定，胞間質(zhì)的釋出先于胞內(nèi)質(zhì)，而膜結(jié)合酶加zui難釋放。

3.2影響因素

影響高壓勻漿破碎的因素主要有壓力、溫度和通過勻漿器閥的次數(shù)。人們普遍關心的是活性物質(zhì)在破碎過程中的失活問題，研究表明蛋白質(zhì)和酶的失活主要由勻漿過程中產(chǎn)生的熱引起的。如果能將溫度控制在35℃以下，那么酶活損失可以忽略。對于溫度敏感性物質(zhì), 低溫操作是必需的。高壓勻漿一般需多級操作，每次循環(huán)前往往進行級間冷卻。盡管提高壓力有利于細胞破碎，但是提高壓力需增加能耗，同時為移走產(chǎn)生的熱量需要付出代價。高壓勻漿法的能耗主要包括提供動力如壓力消耗的能量以及低溫操作耗費的能量。此外，操作壓力對細胞破碎的影響要比勻漿次數(shù)的影響大得多。從提高破碎效率的角度應選擇盡可能高的壓力；而從降低能耗及延長設備壽命的角度應避免很高的壓力。因此，工業(yè)生產(chǎn)中常采用的壓力為55~70Mpa。

3.3存在問題

    除了較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌以及較小的革蘭氏陽性菌不適于用高壓勻漿器處理以外, 其它微生物細胞都可以用高壓勻漿法破碎。另外有些亞細胞器如包含體，質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。但zui近也有人在實驗室嘗試用高壓勻漿器破碎真菌和含有包含體的大腸桿菌。

4 珠磨法：

珠磨法是常用的一種方法，它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細胞獲得破碎。球磨破碎細胞的破碎率可高達95%，用于提取細胞壁，線粒體，核酸，蛋白以及其它細胞器的收率也高。用Dyno mill破碎酵母細胞提取線粒體的收率要比其它機械破碎法要高5-8倍。球磨破碎細胞應用范圍廣，從實驗室到大規(guī)模生產(chǎn)均可使用，并可控制系統(tǒng)及破碎工藝過程的溫度；操作系統(tǒng)密閉，可對系統(tǒng)進行滅菌，避免污染。因此，該技術和設備的發(fā)展和應用受到廣泛關注。

4.1破碎機理

高速珠磨法也是一種有效的細胞破碎方法，珠磨機是該法所用的設備。微生物細胞懸浮液與極細的研磨劑通常是直徑的無鉛玻璃珠在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細胞之間的互相剪切、碰撞促進細胞壁破裂,釋出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。

4.2相關設備

4.2.1球磨容器

實驗室規(guī)模的容積為0.15、0.3和0.6升，工業(yè)規(guī)模的為1.4升到15升，zui大的可達265升，為帶有冷卻夾套的圓桶容器，小型的實驗室使用的是無鉛玻璃制造，而大型的是不銹鋼制造。有通向容器內(nèi)部的菌懸液進料口和球磨劑裝料口。依靠夾具將其固定，很容易更換。

4.2.2驅(qū)動馬達

    驅(qū)動馬達為三相380 V，1.85 KW，2900 rpm的電動馬達。其主動輪通過一個特殊的V型皮帶與攪動軸上的被動輪連結(jié)，利用安裝在操作馬達開關板上的手柄，控制皮帶在主動輪和被動輪上的位置，改變攪動速度。分別達到2000，3000，4500和6000轉(zhuǎn)/秒，這時的攪拌葉的線速度分別為6.7，10，15和20米/秒。

4.2.3電動馬達的控制

控制馬達的開關有兩個按鈕，開和關，安培表，信號燈，在防護罩上有磁性開關，一當防護罩打開，或在操作時未關上，電動馬達不能啟動。

4.2.4攪拌葉

由聚氨酯或不銹鋼制造的直徑為64毫米的圓盤，它們是用墊片和分離子按一定間隔距離將其固定在攪動軸上。

4.2.5分離器

為一種狹縫分離器，它的作用是將研磨劑保留在研磨容器內(nèi)，而使破碎的細胞懸浮液流出。狹縫的寬度是利用不同厚度的標準隔片控制，分別為0.02，0.05，0.1，0.2和0.3 mm。狹縫大小的選擇取決于使用的研磨劑的粒度，一般為研磨劑直徑的三分之一。

4.2.6球磨劑

 球磨劑為無鉛玻璃制造的玻璃珠，直徑范圍zui小的為0.1mm，zui大的為1.5mm，可根據(jù)破碎的細胞種類進行選擇。實驗結(jié)果表明在球磨容器內(nèi)的球磨劑裝量為研磨容器的容積的80-85%為宜。

4.2.7給料泵

為了連續(xù)破碎，可使用能調(diào)速的普通蠕動泵，將細胞懸浮液連續(xù)輸?shù)狡扑槠鲀?nèi)，其供料速度可由需要的破碎率來控制。

4.2.8冷凍設備

由于在細胞破碎過程中高速攪拌，研磨劑與研磨劑，研磨劑與細胞之間的磨擦會產(chǎn)生大量熱量，破碎過程溫度不斷升高，為避免生物活性物質(zhì)失活，對破碎系統(tǒng)進行冷卻是十分必需的。對于Dtno-mill KDL可配用DMK 15/F型的循環(huán)流動式制冷機，對球磨容器和細胞懸浮液儲存器進行冷卻。

4.3影響因素

4.3.1細胞種類及狀態(tài)

利用Dyno-mill KDL進行的細胞破碎試驗表明，不同中屬的微生物細胞在相同條件下破碎時，其破碎效率有明顯差異。差異的主要原因是不同種屬的微生物細胞的大小和形態(tài)，細胞壁或膜的結(jié)構(gòu)不同，另外，因生長條件如培養(yǎng)溫度，時間，營養(yǎng)成份不同使上述的細胞形態(tài)細胞壁結(jié)構(gòu)等也有差別。因此，即使在相同的破碎條件下其破碎效果也不同。換句話說，不同種屬的微生物細胞所需的破碎條件也不相同。從大量文獻中可以總結(jié)出這樣的規(guī)律：按細胞破碎的難易程度是細菌＜酵母＜真菌＜藻類。

4.3.2細胞濃度

在細胞破碎前，需用適當?shù)慕橘|(zhì)，比如緩沖液按細胞重量配制成一定細胞濃度的懸浮液。懸浮液要均勻，要防止有結(jié)塊和沉淀。一級反應動力學的速成常數(shù)應當與細胞濃度無關，但在較高細胞濃度下，破碎過程細胞內(nèi)含物不斷釋放使系統(tǒng)粘度不斷升高，混合速度降低，導致破碎速率下降。在高細胞濃度下，zui大蛋白質(zhì)釋放量(Rm)降低，但破碎率高。低細胞濃度下，細胞的總蛋白質(zhì)釋放量高，并受流出速度影響較?。桓呒毎麧舛认?，細胞的總蛋白質(zhì)釋放量降低，特別是在高流出速度下，總蛋白質(zhì)釋放量隨細胞濃度增加而下降。

除了細胞濃度直接影響破碎物的粘度以外，細胞的保存狀態(tài)也影響著粘度和破碎率。細胞破碎過程中，由于粘度增加，熱傳導能力降低，即使在相同的冷卻條件下，破碎系統(tǒng)的溫度也會增高，溫度的增高會引起蛋白質(zhì)和酶變性，使蛋白質(zhì)和酶的總釋放量降低。

總之，在Dyno-mill上進行細胞破碎，細胞濃度從20%增加到40%，破碎速度常數(shù)僅有很小的變化;細胞濃度增加到50%，破碎速度常數(shù)減小，破碎效率降低。高細胞濃度下，還會發(fā)生細胞破碎物沉淀和蛋白質(zhì)沉淀現(xiàn)象．一般來說，破碎細胞濃度以40%為宜。

4.3.3球磨劑

zui常使用的球磨劑是無鉛玻璃珠，其它的還有不銹鋼珠，聚酯和聚酰胺珠等。

4.3.3.1 球磨劑顆粒大小的影響

一般使用的無鉛玻璃珠的直徑為0.1~1.5 mm，利用大腸桿菌和酵母細胞進行實驗發(fā)現(xiàn)，細胞破碎率隨玻璃珠直徑的增加而降低。對于不同的細胞，由于其大小不同，使用的玻璃珠的zui適直徑也不同。大腸桿菌和陰溝腸桿菌使用0.1 mm的玻璃珠進行破碎的效率zui高；而酵母細胞使用0.25~0.5 mm的研磨劑zui宜。

實際操作時，一般不使用0.1 mm的球磨劑，即使破碎細菌也使用0.25~0.5 mm的玻璃珠。其原因有三：一、用0.1 mm的玻璃珠破碎速度雖高，時間短，若破碎時間控制不嚴，對酶有破壞作用，破碎物的酶活會下降；二、小珠機械研磨產(chǎn)生熱量高；三、選擇狹縫分離器時，狹縫的大小應當是使用的研磨劑直徑的三分之一，使用0.1 mm的玻璃珠，狹縫應選用0.03 mm的，這樣的狹縫分離很慢，大規(guī)模破碎時很困難。玻璃珠作球磨劑，使用100 h的損失不超過3%，一年后檢查分離器通道無重大變化，說明玻璃珠可以長期反復使用。還發(fā)現(xiàn)使用的玻璃珠大小與酶在細胞內(nèi)的位置及細胞濃度有關。

4.3.3.2裝量的影響

使用無鉛玻璃珠作球磨劑，一般的裝量為研磨容器容積的80~85%。隨球磨劑裝量的降低，細胞破碎效率也降低，同時研磨過程中產(chǎn)生的熱量也減少。因此，如果破碎釋放的活性物質(zhì)不耐熱，而且設備冷卻又差，需適當減少球磨劑的裝量。另外，若細胞懸浮液或破碎物的粘度很高時，也需適當降低球磨劑的裝量。

4.3.4攪動速度

 Dyno-mill 的攪動軸有四個轉(zhuǎn)速，即2000，3000，4500和6000 r/min，相應的攪拌葉輪的線速度為6.9，10，15和20 m/s。

在球磨細胞破碎過程中，馬達驅(qū)動軸帶動攪拌葉轉(zhuǎn)動是細胞破碎的維一能量來源。因此，攪拌葉的轉(zhuǎn)速決定著細胞破碎的速度和程度。大多數(shù)試驗證明，細胞破碎速率隨攪拌葉轉(zhuǎn)速的增加而增加，但在很高的轉(zhuǎn)速下細胞破碎速率不會成比例增加，有時還可能下降。

4.3.5葉輪結(jié)構(gòu)

經(jīng)常使用的攪動葉輪有兩種，一種是由聚氨基甲酸酯材料制造，具有開放式的結(jié)構(gòu)；另一種是用不銹鋼制造的，結(jié)構(gòu)上不如聚氨基甲酸酯的開放。不同材質(zhì)和結(jié)構(gòu)的攪動葉輪在操作中因攪動效果的差異，使破碎系統(tǒng)的溫度變化也不同。在低轉(zhuǎn)速下，較開放的聚氨酯葉輪的破碎效率較低，這是由于反逆作用所造成的。在高轉(zhuǎn)速下，有較高的攪動效率，且能耗也增加。

為增加攪動效率，可以使攪拌葉安裝成與軸有一定角度，其作用是增加分散能力，但這樣會使連續(xù)破碎的能力減??；因增加了能量到細胞懸浮液中的傳遞能力，而有較高的破碎速度，但能量效率降低，特別是在高轉(zhuǎn)速下。

4.3.6流速

細胞破碎與攪動速度有關,在高攪動速度下，流速的變化對細胞破碎率影響較小，而在低的攪動速度下，流速對破碎率的影響較大。

4.3.7溫度

目前還沒有溫度對破碎過程影響的詳細研究報告，由于破碎為產(chǎn)熱過程，直接影響破碎物的粘度及酶的活性和蛋白質(zhì)總量的釋放，一般來說，破碎溫度越高，細胞蛋白質(zhì)的釋放量越低。

5 兩種方式的比較：

    高壓勻漿法同高速珠磨法相比各有特點, 間歇處理少量樣品時, 勻漿法優(yōu)于珠磨法。前者操作參數(shù)少, 易于確定,而且樣品損失量少, zui少可處理20ml懸浮液。珠磨機操作參數(shù)多, 一般憑經(jīng)驗估計, 并且珠子之間的液體損失使一次處理懸浮液zui終只能得到左右的漿液。連續(xù)操作時珠磨機顯示出*性, 首先它兼具破碎和冷卻雙重功能, 減少了產(chǎn)物失活的可能性, 而高壓勻漿器需配備換熱器進行級間冷卻其次珠磨法破碎效率高, 在適當條件下一次操作就能達到較高的破碎率, 而高壓勻漿法往往需循環(huán)一次才行再者幾乎所有種類的微生物細胞都可以用珠磨機破碎, 包括含有包含體的基因工程菌的破壁, 質(zhì)地堅硬的包含體可以充當研磨劑, 更有利于細胞破壁, 而高壓勻漿器則有一定的局限性。

6 細胞破碎技術研究的發(fā)展方向：

6.1多種破碎方法相結(jié)合

化學法與酶法取決于細胞膜壁的化學組成，機械法取決于細胞結(jié)構(gòu)的機械強度，而化學組成又決定了結(jié)構(gòu)的機械強度，組成的變化必然影響到強度的差異，這就是化學法或酶法與機械法相結(jié)合的原理。

6.2與上游過程相結(jié)合

在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基、生長期、操作參數(shù)如、溫度、通氣量、稀釋率等因素對細胞破碎都有影響，因此細胞破碎與上游培養(yǎng)有關。另一方面用基因工程的方法對菌種進行改造也是非常重要的。這方面的工作包括以下幾個方面：包含體的形成、克隆噬菌體溶解基因、耐高溫產(chǎn)品的基因表達。

6.3與下游過程相結(jié)合

細胞破碎與固一液分離緊密相關，對于可溶性產(chǎn)品來講，碎片必須除凈，否則將造成層析柱和超濾膜的堵塞，縮短設備的壽命。因此必須從后分離過程的整體角度來看待細胞破碎操作，機械破碎操作尤其如此。

7 總結(jié)：

細胞破碎技術的發(fā)展極大程度上也推動了細胞胞內(nèi)產(chǎn)物工業(yè)化的生產(chǎn)。在運用細胞破碎方法時，要分析實際需求、結(jié)合前人經(jīng)驗，同時也可多種方法結(jié)合使用，以求達到性價比zui大化。

慧穎生物常備各種細胞株細胞系，有需要的老師請來電/